Сравнительное экспериментальное исследование острого и подострого токсического действия коньяка и виски

Нужный В.П. д.м.н., рук. лаборатории токсикологии НИИ наркологии (НИИН) Минздрава России, Москва
Забирова И.Г. к.б.н., ст. научн. сотр. НИИН
Суркова Л.А. к.б.н., ст. научн. сотр. НИИН
Листвина В.П. научн. сотр. НИИН
Самойлик Л.В. научн. сотр. НИИН
Демешина И.В. научн. сотр. НИИН
Савчук С.А. к.техн.н., вед. научн. сотр. Центральной химико-токсикологической лаборатории ММА им. И.М.Сеченова
Львова Ю.А. аспирант НИИН

В обществе, включая представителей медицины и производителей ликероводочной продукции, бытует представление о том, что среди крепких алкогольных напитков наименее опасным для здоровья является водка. Данное представление основано на том, что водка, производимая методом ректификации, является наиболее «чистым», рафинированным продуктом, в котором «вредные» для здоровья примеси содержатся в минимальных количествах. Действительно, содержание разнообразных летучих и нелетучих соединений в алкогольных напитках производимых методом дистилляции и особенно тех, которые выдерживают в дубовой таре, существенно выше, чем в водке.
К токсичным примесям, присутствующим в алкогольных напитках обычно относят метанол, ацетальдегид, высшие спирты и некоторые другие. Анализ литературных данных по токсикологии этилового спирта и его примесей позволяет заключить, что острая токсичность этилового спирта и разнообразных алкогольных напитков, включая низкокачественные, определяется, в основном, этанолом или только этанолом. Так, например, в опытах на грызунах установлено, что среднесмертельная доза (ЛД50) этанола, ацетальдегида, метанола, н-пропанола, изопропанола, изобутанола, н-амилового и изоамилового спиртов при условии их поступления через желудок различается незначительно и лежит в диапазоне 2,8-9,4 г/кг [1].
Тем не менее, перечисленные выше примеси и другие компоненты, содержащиеся в алкогольных напитках произведенных методом дистилляции, могут оказывать выраженное модифицирующее (усиливающее или ослабляющее) влияние на токсические эффекты этилового спирта или оказывать независимое от этанола токсическое действие.
В эксперименте на животных установлено, что метанол в тех концентрациях, в которых он присутствует в большинстве алкогольных напитков (0,1-1,0 г/л), не оказывает влияния на острые токсические эффекты этанола. Однако, в концентрациях 1,0-6,0 г/л он дозозависимо усиливает выраженность наркотического, летального и подострого токсического действия этанола [4]. Необходимо учитывать и то обстоятельство, что содержание метанола в организме может существенно увеличиваться в результате его эндогенного синтеза при употреблении пектинсодержащих алкогольных напитков или при сочетанном употреблении алкоголя с фруктами и фруктовыми соками [18].
Другие компоненты также могут оказывать сходное токсическое действие. Так, например, сивушное масло и эфироальдегидная фракция, отделяемые в процессе ректификации спирта сырца, при внесении их в ректификованный этиловый спирт в тех количествах, в которых они присутствуют в некоторых дистиллированных алкогольных напитках (самогон, граппа, ракия), способны дозозависимым образом увеличивать наркотическое и летальное действие этанола [3].
В экспериментах проводившихся на здоровых людях - волонтерах в условиях дозированной нагрузки алкоголем предпринимались попытки оценить способность разных алкогольных напитков вызывать развитие постинтоксикационного состояния (ПС, состояние похмелья). В части исследований было показано, что напитки, содержащие большое количество примесей провоцируют более выраженное ПС. В других аналогичных по задачам и исполнению работах такой зависимости не обнаружено. В одной из работ установлено, что внесение в водку высших спиртов (н-пропиловый, изоамиловый и амиловый) в количестве двукратно превышающем уровень тех же спиртов в виски «Бурбон», приводит к отчетливому ухудшению психомоторных реакций волонтеров как в фазу интоксикации, так и в фазу ПС [2].
В популяционных исследованиях показано, что длительное, систематическое употребление вина и некоторых дистиллированных алкогольных напитков, прежде всего виски и кальвадоса, увеличивает риск развития злокачественных новообразований в полости рта, пищеводе и в нижних отделах желудочно-кишечного тракта [15, 16, 17, 25]. А длительное злоупотребление вином (но не пивом или дистиллированными алкогольными напитками) повышает риск развития рака желудка [19].
Канцерогенный эффект алкогольных напитков связывают с действием присутствующих в вине, виски, бренди и кальвадосе этилкарбамата (уретан), а также с влиянием этанола на обмен нитрозаминов. Установлено, что этанол блокирует основной путь биотрансформации этилкарбамата. При этом активируется минорный путь его метаболизма с образованием винилкарбамата, который обладает выраженным мутагенным действием [23]. Этанол является также эффективным модулятором биотрансформации содержащихся в некоторых алкогольных напитках и в сопутствующих продуктах питания нитрозаминов, способствуя образованию эзофагального канцерогена – нитрозометилбензиламина [25]. Аналогичное действие оказывает и изоамиловый спирт, содержание которого в дистиллированных напитках, особенно в кальвадосе, может достигать значительных величин [21].
Некоторые исследователи связывают канцерогенное действие указанных выше алкогольных напитков с влиянием содержащихся в них полифенольных соединений [11]. Другие полагают, что высокое содержание полифенольных соединений в пиве, коньке и некоторых сортах виски (в отличие от водки, рома и джина) обеспечивает высокий общий антиоксидантный статус этих напитков, благодаря чему они оказывают антимутагенное и антиатерогенное действие подобно красному виноградному вину [14, 12].
Сравнительное исследование способности разных алкогольных напитков оказывать генотоксическое действие показало, что все некоторые из них, особенно текила, обладают такой способностью [20].
Установлено, что в процессе спиртового брожения в алкогольных напитках (пиво, вино) накапливаются соединения, обладающие выраженной способностью стимулировать секрецию кислоты и высвобождение гастрина в желудке, приводя к развитию гастроэзофагального рефлюкса и повреждению слизистой оболочки желудка и пищевода. В процессе дистилляции или ректификации данные соединения удаляются или разрушаются. Поэтому водка, коньяк, виски и другие дистиллированные алкогольные напитки не оказывают столь существенного влияния на слизистую оболочку пищевода и желудка [13, 22, 24].
Нетрудно заметить, что среди работ по сравнительной токсикологии алкогольных напитков почти отсутствуют исследования, касающиеся изучения острых токсических эффектов алкогольных напитков произведенных методами ректификации и дистилляции и их способности провоцировать развитие физической зависимости от алкоголя.
Цель настоящего исследования заключалась в изучении особенностей острого и подострого токсического действия коньяка и виски по сравнению с 40% раствором ректификованного этилового спирта марки «Экстра». В задачи исследования входило изучение химического состава указанных напитков, анализ параметров их острого токсического действия (летальное и наркотическое действие), а также оценка их способности провоцировать развитие постинтоксикационных расстройств и вызывать развитие физической зависимости от алкоголя.

Материал и методы исследования

Исследованию подвергали коньяк Hennessy v.s., произведенный по классической технологии одноименной фирмой во Франции и шотландский смешанный виски Catty Sark производства фирмы Berry Brothers and Rudds. Напитки для исследования предоставлены фирмой ООО «ВЛ Энтерпрайзес».
В качестве эталона для сравнения использовали спирт этиловый ректификованный из зерносмеси пшеницы и ржи марки «Экстра», произведенный на АО «Алвист» в г. Бежецк Тверской области и полученный непосредственно на предприятии – производителе. Спирт соответствовал ГОСТ З 51652-2000 и СанПиН 2.3.2.560-96. Спирт разводили водой до концентрации 40%, об. (31,6%, вес/об.).
Исследования проводили на крысах-самцах линии NMRT с массой тела 18-20 г. и крысах-самцах линии Wistar с массой тела 200-240 г. Мышей получали в зоопитомнике «Столбовая» РАМН, а крыс в зоопитомнике Института фармакологии РАМН. Животных содержали в клетках производства ЧССР в группах по 6 особей при смешанном освещении в кондиционированном виварии (24оС) в условиях свободного доступа к воде и корму (стандартный сбалансированный гранулированный корм).
Напитки и раствор этанола вводили внутрижелудочно с использованием металлических зондов разного размера с оливой на конце. Контрольным животным вместо напитков вводили эквиобъемное количество воды.
Методология исследований основывалась на представлениях и подходах разработанных в НИИ наркологии МЗ РФ [5].
Содержание этанола в исследуемых напитках определяли весовым методом (ГОСТ З 51135-98, п.5.3.).
Определение летучих и нелетучих соединений в напитках проводили методами газовой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии с использованием хромато-масс-спектрометрической системы (Hewlett-Packard, США), включающей в себя масс-селективный детектор HP-5973(MSD) и газовый хроматограф HP-6890. Методика определения описана в предшествующих работах [8, 9].
Исследование летального действия. Тест-объект – мыши. Регистрируемые показатели ЛД16, ЛД50 и ЛД84 за 5 суток наблюдения. Для введения напитков использовали шприц с ценой деления 0,02 мл. Диапазон исследуемых доз составлял 6,0-9,2 г/кг этанола с шагом в 0,4 г/кг. Количество животных в каждой группе – 7.
Исследование выраженности и динамики наркотического действия проводили на крысах с использованием визуального способа оценки. Напитки и раствор этанола вводили в дозе соответствующей 4,5 г/кг этанола. Состояние животных оценивали в баллах по специальной шкале каждый час на протяжении 11 часов с момента введения [3].
Содержание этанола в крови через 3 и 8 часов после введения животным напитков и раствора спирта определяли методом газовой хроматографии [10] на хроматографе ЛХМ-8МД (РФ).
Оценку тяжести постинтоксикационного состояния проводили на крысах с использованием тестов «вращающийся стержень» и «открытое поле» [6]. Напитки и раствор этанола вводили в дозе эквивалентной 6 г/кг этанола. Животных подопытных групп и контрольных крыс за сутки до начала опыта тренировали на вращающемся стержне дважды по две мин. с интервалом в 2 часа при скорости вращения стержня 6-8 об./мин. Перед введением спиртосодержащих жидкостей или воды проводили исходное тестирование, регистрируя время удерживания крыс на стержне, вращающемся со скоростью 18 об./мин. Спустя 17-19 часов после введения исследуемых напитков или воды проводили повторное тестирование при той же скорости вращения стержня. Непосредственно перед тестированием на вращающемся стержне животных обследовали в открытом поле (время пребывания каждой крысы в этих условиях – 5 мин.).
Форсированная многосуточная алкоголизация. Крысам в течение 6-ти суток с интервалом в 12 часов вводили внутрижелудочно напитки и раствор этанола. На протяжении первых 3-х суток спиртосодержащие жидкости вводили в одинаковых, фиксированных по этанолу дозах (4,5, 2,5, 5,0, 5,0, 6,0, 6,0 г/кг). В последующие 3-е суток – в максимально переносимых дозах, которые подбирались индивидуально для каждого животного дозах в зависимости от их состояния к моменту очередного введения (около 6,0 г/кг этанола). Подбор доз проводился в соответствии со специально разработанной инструкцией [7]. Контролируемый показатель – суммарная доза этанола полученная животными за весь период алкоголизации. Регистрируемые показатели: динамика суточных доз (характеристика формирования толерантности к этанолу), изменение массы тела за период алкоголизации, смертность животных за период алкоголизации.
Оценку тяжести синдрома отмены этанола у крыс перенесших форсированную алкоголизацию проводили визуально через 12-24 часа после последнего введения напитков по специально разработанной ранжированной шкале [7].
Оценка наличия и выраженности поражения печени проводилась на крысах перенесших синдром отмены этанола – спустя трое суток после последнего введения напитков и раствора этанола. Печень перед отбором образцов ткани перфузировали физиологическим раствором. В гомогенатах определяли активность активность аланин- и аспартатаминотрансфераз АСТ и АЛТ динитрофенилгидрозиновым методом по Райтману и суммарное содержание триглицеридов с использованием наборов реагентов фирмы «Лахема» (Чехия). Дополнительно в гомогенатах печени исследовали содержание малонового диальдегида. Измерения проводили на спектрометре КСК-3 (РФ).
Степень повреждения слизистой оболочки желудка оценивали у животных перенесших синдром отмены этанола – спустя трое суток после последнего введения напитков и раствора этанола посредством макроскопического изучения слизистой оболочки под бинокулярной лупой. Регистрируемые показатели: выраженность катаральных изменений слизистой, количество свежих язв и эрозий. Степень поражения выражали в баллах.
Полученные результаты обрабатывали с помощью программы «Statistica» в среде Windows (критерий Стьюдента). Все данные представлены в виде M±S.D. (за исключением ЛД50).

Результаты исследования

Содержание этанола в виски Catty Sark составило 43,0%, об., а коньяке Hennessy v..s. 40,0%, об., что соответствовало надписям на этикетках бутылок.
Химический состав летучих соединений представлен в табл. 1. Для сравнения проведен анализ содержания тех же соединений в образцах коньяка Hennessy v.s.o.p., отечественного коньяка и итальянской виноградной граппы. Из таблицы следует, что содержание летучих примесей в исследуемых напитках многократно выше, чем в водно-спиртовом растворе, использованном в качестве контроля. Этиловый спирт из которого готовился раствор содержит (в мг/л): альдегиды – 3,4, компоненты сивушного масла (1-пропанол, 2-пропанол, изобутанол, 1-бутанол, изоамиловый спирт) – 5,6, сложные эфиры – 7,4 и метанол – 58.
Исследуемые коньяк и виски оказались очень близкими по содержанию летучих примесей. Исключение составляет изоамиловый спирт. Его содержание в коньяке в 3,5-4,0 раза выше, чем в виски.
Исследуемые напитки отличаются низким для этой категории напитков содержанием компонентов эфироальдегидной фракции погона. Так, например, содержание ацетальдегида в них в 2-6 раз ниже, чем в напитках сравнения, содержание этилацетата в 6-8 раз ниже, чем в отечественном коньяке и в 1,5-2,0 раза ниже, чем в граппе, а содержание метанола – на порядок ниже, чем в граппе и примерно такое же, как в отечественном коньяке. Напротив, содержание изобутанола и изоамилового спирта в исследуемых напитках (особенно в коньке) оказалось выше, чем в напитках сравнения.
В исследуемых напитках отсутствуют или почти отсутствуют диацетил, изовалериановый альдегид, втор-бутанол и органические кислоты (пропионовая, масляная, изомасляная и валериановая), а содержание уксусной кислоты в пределах допустимой нормы. Все это свидетельствует о высоком качестве этих напитков. Вместе с тем содержание фурфурола в исследуемом коньяке оказалось в 2-4 раза выше (около 12 мг/л), чем в виски и напитках сравнения. Альдегид фурфурол относится к категории токсичных соединений. Присутствие его в пищевом этиловом спирте не допускается, а содержание в коньячном спирте, согласно отечественному нормативу (ГОСТ Р 51145-98), не должно превышать 3,0 мг/л безводного спирта.
Химический состав нелетучих соединений полифенольной природы приведен в табл. 2. Вещества этого типа присутствуют в исследуемых напитках и напитках сравнения примерно в одинаковых концентрациях. Исключение составляет отечественный коньяк, в котором содержание галловой кислоты на порядок выше, чем в других напитках.
Исследование летального действия напитков показало, что ЛД50 за 5 суток наблюдения составляет (M±m) для раствора эталонного этилового спирта – 7,47±0,2, для коньяка - 7,33±0,2 и для виски - 7,44±0,2. Статистически значимые различия показателей отсутствуют. Наклон кривой доза/эффект у этих напитков одинаков.
Результаты исследования наркотического действия напитков представлены на рис. 1, из которого следует, что динамика и выраженность наркотического состояния животных после введения исследуемых напитков и контрольного раствора этанола практически идентичны. Интегральный показатель наркотического действия (сумма баллов за весь период наблюдения) составил для раствора спирта – 35,2±5,1, коньяка – 35,0±4,7 и виски – 33,4±5,7.
Показатели содержания этанола в крови крыс (г/л) после введения им раствора спирта, коньяка и виски статистически значимо не различались и составили через 3 часа после введения 1,59±0,25, 1,62±0,35 и 1,44±0,25, соответственно. Через 8 часов после введения те же показатели равнялись 1,10±0,22, 1,03±0,39 и 0,91±0,29, соответственно.
Оценка тяжести постинтоксикационного состояния, проводившаяся с использованием теста «открытое поле» (табл. 3) показала, что однократное воздействие раствором этилового спирта в высокой дозе не повлияло на поведение животных (по сравнению с контролем). Обычно в этой ситуации фиксируется угнетение двигательной и исследовательской активности [6]. По всей вероятности крысы данного помета обладали повышенной толерантностью к токсическому действию этанола. Вместе с тем, у животных получавших коньяк отмечена определенная тенденция к снижению двигательной активности и увеличению времени пассивного поведения. Значительно более выраженные аномалии поведения были зафиксированы у крыс получавших виски. У этих животных была достоверно снижена «горизонтальная» и «вертикальная» двигательная активность, а время пассивного поведения были увеличены почти в два раза.
Применение теста «вращающийся стержень» у крыс контрольной группы не подвергавшихся воздействию алкоголем показало, что у этих животных регистрируется отчетливо выраженная тенденция к увеличению времени удерживания на стержне (феномен тренированности). У всех крыс переживших острую алкогольную интоксикацию указанный феномен отсутствовал. Различий во времени удерживания на стержне у крыс, подвергавшихся воздействию раствором спирта, коньяка и виски не обнаружено
При проведении форсированной многодневной алкоголизации животных установлено, что суммарная доза этанола (г/кг) у крыс подвергавшихся воздействию раствором спирта, коньяком и виски была одинакова и составила 67,3 ±3,5, 66,6±3,1 и 68,3±1,9, соответственно. В период алкоголизации у животных этих групп отмечалась одинаковая по выраженности задержка в приросте массы тела. Гибель животных в разных группах составила 6-12%.
Результаты оценки способности исследуемых напитков вызывать развитие физической зависимости от алкоголя представлены на рис. 2. Прекращение форсированной алкоголизации сопровождалось появлением у большинства животных признаков синдрома отмены средней степени выраженности. Наиболее тяжелые из них – спонтанная вокализация и судороги клонические.
У крыс подвергавшихся воздействию коньяком синдром отмены этанола, судя по ряду показателей (тремор лап и встряхивание телом), протекал менее тяжело. На это указывает выраженная тенденция к уменьшению частоты встречаемости системного тремора (29,4% против 62,5% в контроле), к уменьшению частоты встречаемости судорожного синдрома (5,9% против 18,8% в контроле) и отчетливо выраженная тенденция к снижению интегрального показателя тяжести синдрома отмены (5,8±4,7 баллов против 7,5±3,3 в контроле).
Еще более благоприятно протекал постинтоксикационный период у крыс подвергавшихся воздействию виски. У этих животных зарегистрировано статистически значимое (p<0,05) снижение выраженности следующих проявлений синдрома отмены: симптом Штрауба, тремор лап и системный тремор. По сравнению с контролем (раствор спирта) у этих животных отмечена отчетливая тенденция к уменьшению частоты встречаемости таких проявлений, как геморрагии вокруг носа, кататония, скандированность походки и судороги клонические. Интегральный показатель тяжести синдрома отмены в этой группе составил 4,8±2,8 балла и был ниже (p<0,05), чем у животных алкоголизированных раствором спирта.
Результаты исследования состояния печени и слизистой оболочки желудка подопытных крыс представлены в таблице 4. Форсированная алкоголизация раствором этилового спирта приводит к увеличению активности АЛТ и АСТ, а также к увеличению содержания триглицеридов и малонового диальдегида в печени. Эти изменения характеризуют начальную, обратимую фазу алкогольного поражения печени. Коньяк и виски провоцировали развитие одинакового по выраженности деструктивного процесса в печени. Аналогичным образом раствор спирта и исследуемые напитки вызывали одинаковые по выраженности изменения в слизистой оболочке желудка.

Заключение

Результаты проведенного экспериментального исследования свидетельствуют о том, что высококачественные алкогольные напитки, полученные путем дистилляции с последующей выдержкой в дубовой таре и содержащие значительное количество летучих и нелетучих соединений (коньяк, виски) по параметрам острой токсичности (летальное и наркотическое действие) не отличаются от раствора высококачественного ректификованного этилового спирта аналогичной крепости.
Виски, в отличие от раствора спирта и коньяка, судя по результатам теста «открытое поле», вызывает более выраженные нарушения поведения животных, характеризующие тяжесть острого постинтоксикационного состояния. При использовании теста «вращающийся стержень» различий способности испытанных алкогольных напитков провоцировать развитие указанного состояния не обнаружено.
Подострая тяжелая алкогольная интоксикация, вызываемая раствором спирта, коньяком и виски, приводит к развитию одинаковых по выраженности повреждений в печени и слизистой оболочке желудка животных.
Коньяк и особенно виски по сравнению с раствором ректификованного этилового спирта обладают менее выраженной способностью вызывать синдром отмены этанола после прекращения многодневной форсированной алкоголизации крыс.
Полученные результаты позволяют предположить, что минорные компоненты, присутствующие в коньяке и виски, препятствуют развитию физической зависимости от алкоголя.
Резюме

В эксперименте на животных (крысы, мыши) установлено, что алкогольные напитки, полученные методом дистилляции с последующей выдержкой в дубовой таре (коньяк Hennessy v.s. и виски Catty Sark), по параметрам острой токсичности (летальное и наркотическое действие) и подострой токсичности (повреждение печени и слизистой оболочки желудка) не отличаются от раствора высококачественного ректификованного этилового спирта аналогичной крепости. Коньяк и особенно виски по сравнению с раствором ректификованного этилового спирта обладают менее выраженной способностью вызывать синдром отмены этанола после прекращения многодневной форсированной алкоголизации крыс. Полученные результаты позволяют предположить, что минорные компоненты, присутствующие в коньяке и виски, препятствуют развитию физической зависимости от алкоголя.


Приложение 1.Химический состав (летучие соединения) коньяков Hennessy и виски Catty Sark, коньяка российского производителя (5 лет выдержки) и граппы (Италия).

Приложение 2.Химический состав (нелетучие соединения) коньяков Hennessy, виски Catty Sark, коньяка российского производителя (5 лет выдержки) и виски Bourbon (США).